Czym jest elektroforeza?
Elektroforeza jest zjawiskiem elektrokinetycznym polegającym na ruchu cząstek pod wpływem pola elektrycznego. Zachodzi ono w środowisku nieruchomej fazy rozpraszającej, którą może być np. żel. Ruchowi natomiast podlegają cząstki fazy rozproszonej mające ładunek dodatni lub ujemny, czyli kationy i aniony. Zjawisko to opiera się na prawidłowości polegającej na tym, że cząstki poszczególnych faz różnią się ruchliwością elektroforetyczną. Jest ona wprost proporcjonalna do ładunku elektrycznego i odwrotnie proporcjonalna do wielkości cząstki. W pewnym stopniu zależy też od jej kształtu.
Elektroforeza może mieć jedną z dwóch form:
- anaforezy – jeśli ruch cząstek odbywa się w kierunku anody,
- kataforezy – jeśli ruch cząstek odbywa się w kierunku katody,
Elektroforeza jest techniką analityczną zastosowaną po raz pierwszy w 1908 roku przez Karla Landsteinera, który w ten sposób oddzielił białka z surowicy krwi.
Elektroforeza DNA – zastosowanie
Za pomocą elektroforezy można rozdzielać różne cząstki, a także dokonywać pomiarów masy cząsteczkowej i badać polidyspersję polimerów syntetycznych. Najczęściej jednak metoda ta znajduje zastosowanie w genetyce jako elektroforeza DNA. Celem przeprowadzania takiego badania zwykle jest wizualizacja produktów reakcji PCR, klonowania lub cięcia enzymami restrykcyjnymi. Zależnie od tego, jakie efekty chce się uzyskać, jako środowisko nieruchome stosuje się różne substancje. Najczęściej są to żele agarozowe i poliakrylamidowe.
Przebieg elektroforezy DNA w środowisku żelowym
Najpopularniejszą metodą przeprowadzania elektroforezy DNA jest zastosowanie środowiska żelowego z dodatkiem agarozy. Jest to polimer cukrowy pozyskiwany ze ścian komórkowych krasnorostów. Substancja w postaci proszku odpowiada za usieciowienie żelu, a im jest jej więcej, tym dokładniejszy będzie rozdział cząstek DNA. Wynika to ze wzrostu gęstości żelu (wyższa rozdzielczość) oraz większego oporu, jaki muszą pokonać przeciskające się przez pory cząstki DNA. Przed dodaniem do żelu agarozę rozpuszcza się w buforze (TAE lub TBE), w wysokiej temperaturze. Dzięki temu prąd lepiej przepływa przez środowisko stałe.
Migracja cząstek DNA w środowisku żelowym jest efektem ujemnego potencjału, jaki gromadzą one na powierzchni. Dzięki temu są przyciągane przez elektrodę o przeciwnym ładunku. Jednocześnie żel zapobiega dyfuzji, czyli mieszaniu się cząstek pod wpływem przypadkowych zderzeń. Na szybkość ich przemieszczania się wpływają:
- różnica potencjałów między elektrodami,
- opór środowiska,
- lepkość żelu,
- stężenia buforu (elektrolitu),
- pH i temperatura buforu,
- stężenie agarozy,
- masa cząsteczkowa DNA.
Ta ostatnia pozwala porównać migrację do przechodzenia przez sito o różnej wielkości oczek. Im mniejsza cząsteczka, tym mniejsze „otwory” są dla niej dostępne, a przemieszczanie się następuje szybciej. Przykładowo stężenie agarozy w żelu 0,3 pozwala na rozdzielanie DNA w zakresie 5-60 [kpz], a stężenie 2,0 – odpowiednio 0,1-2 [kpz].
Odczynniki chemiczne stosowane w elektroforezie DNA
W celu interpretacji wyników elektroforezy DNA stosuje się próbki nanoszone na żel. Stanowią one standard służący do porównywania zachowania badanych cząstek. Do identyfikacji służą specjalne odczynniki chemiczne umożliwiające wybarwianie DNA i żelu. W ich dystrybucji specjalizuje się firma Argenta, zaopatrująca również laboratoria w inne odczynniki, sprzęt i materiały zużywalne niezbędne do badań. Wśród powszechnie stosowanych barwników jest bromek etydyny (bromek 2,7-diamino-N-etylo-6-fenylo-fenantrydyny), który świeci pod wpływem promieni UV. Zastosowanie mają też srebro, GelRed oraz specjalistyczny barwnik stains-all, wybarwiający DNA na niebiesko. Natomiast do barwienia próbek wykorzystuje się błękit bromofenolowy, cyjanol ksylenowy oraz oranż C.
